一、CSDS模型研究背景
CSDS的全稱是chronic social defeated stress，又稱慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激模型，是一種用來(lái)制作動(dòng)物抑郁模型的方法。在神經(jīng)精神病學(xué)研究領(lǐng)域中，引起人們極大興趣的是開(kāi)發(fā)有效的抑郁癥動(dòng)物模型，以幫助理解抑郁癥背后的神經(jīng)生物學(xué)和分子機(jī)制。慢性應(yīng)激的各種模型已被用于在小鼠中誘發(fā)與抑郁相關(guān)的癥狀，其中包括慢性不可預(yù)測(cè)的應(yīng)激，足部震顫，固定應(yīng)激，然后進(jìn)行性yu減退或類似絕望行為的測(cè)量（例如，蔗糖偏愛(ài)測(cè)試，強(qiáng)迫游泳測(cè)試和尾巴懸吊測(cè)試），但它們并未很好地驗(yàn)證為人類抑郁癥的模型。
當(dāng)前，慢性社交挫敗壓力由于其可靠性和可重復(fù)性而被廣泛接受為抑郁癥的有效模型。由于以下原因，社交失敗范例已被證明是人類抑郁的良好模型：
1）易感小鼠的抑郁表型（社交回避，快感不足，代謝變化等）。可以通過(guò)抗抑郁藥的長(zhǎng)期治liao來(lái)逆轉(zhuǎn)，但不能通過(guò)急性給藥來(lái)逆轉(zhuǎn)。
2）社會(huì)挫敗壓力會(huì)產(chǎn)生易感表型和適應(yīng)性表型，這可用來(lái)解釋抑郁癥病理生理學(xué)中人類壓力敏感性的個(gè)體差異。
3）社交失敗壓力誘發(fā)的易感表型在大腦獎(jiǎng)勵(lì)電路中伴隨遺傳和表觀遺傳變化而持久。
二、設(shè)備及軟件（建議）
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透明的鼠籠（帶襯墊的一次性鼠籠）
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標(biāo)準(zhǔn)水瓶（鼠標(biāo)水瓶）
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帶吸管的水瓶塞（氯丁橡膠塞，1英寸彎曲管–尖頭）
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氣缸（定制，用于額外注水的塑料支架）
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分壓器（定制，透明的多孔有機(jī)玻璃板）
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可移動(dòng)外殼（定制，透明有機(jī)玻璃，頂部和底部打開(kāi)）
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秒表
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開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱（定制，44 [w] x 44 [d] x 30 [h] cm）
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用于社交互動(dòng)測(cè)試的視頻跟蹤系統(tǒng)（例如，上海欣軟，VisuTrack動(dòng)物行為分析軟件，CCD攝像頭和計(jì)算機(jī)）
三、 慢性社交挫敗應(yīng)激模型的建立
（1）傳統(tǒng) CSDS 建模方法
該部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是參照了有關(guān)文獻(xiàn)：Kudryavtseva NN，Bakshtanovskaya IV，Koryakina LA. Socialmodel of depression in mice of C57BL/6J strain［J］. Pharmacol Biochem Behav，1991，38（2）：315-320.
首先根據(jù)需要選取一定數(shù)量的CD 1小鼠作為攻擊性小鼠，在正式實(shí)驗(yàn)前2-3周開(kāi)始對(duì)其攻擊性進(jìn)行篩選。具體方法就是:每個(gè)飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)雄性和雌性兩只周齡相近的CD1小鼠，一定時(shí)間內(nèi)讓CD1雄性小鼠產(chǎn)生領(lǐng)地意識(shí)；1周以后，將配對(duì)飼養(yǎng)的雌鼠分離出飼養(yǎng)籠，隨機(jī)放入一只陌生的C57小鼠作為領(lǐng)地入侵者，如果CD1雄性小鼠在1 min之內(nèi)就開(kāi)始對(duì)C57小鼠發(fā)動(dòng)攻擊，那么該CD1小鼠則被視為攻擊性CD1小鼠。運(yùn)用同樣的方法篩選出所有需要的攻擊性雄性CD1小鼠。正式實(shí)驗(yàn)前，選取雄性C57小鼠(7周)，隨機(jī)分配成正常組和應(yīng)激組，每組10只，對(duì)照組每2只一籠，其余均單籠飼養(yǎng)，給正常飲食飲水一周充分適應(yīng)環(huán)境。當(dāng)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，提前分離CD1雌鼠，取模型組C57小鼠一只，直接放入陌生雄性CD1小鼠（8-9周）飼養(yǎng)籠中，使C57小鼠遭受雄性CD1小鼠持續(xù)性攻擊約5-10 min;然后將兩只小鼠用帶有密集小孔的透明塑料隔板隔開(kāi)，使兩只小鼠彼此仍能互視和聞嗅但是無(wú)法接觸，運(yùn)用這種方法持續(xù)到下次進(jìn)行攻擊前為止，完成該過(guò)程后即為第1天應(yīng)激。第2天再將該C57鼠放入另一不同的CD1雄性鼠的籠中，使C57小鼠受到相同程度的應(yīng)激;第三天再放入第三只CD1雄性鼠的籠中，同樣使C57小鼠受到同樣程度的應(yīng)激。如此連續(xù)應(yīng)激10天，并保證每tian同一只C57小鼠受到不同CD1雄性鼠的攻擊。在此期間，對(duì)照組和應(yīng)激組C57小鼠均維持正常飲食飲水，而對(duì)照組則保持2只一籠，每tian相互更換接觸不同的小鼠。
（2）改進(jìn)型慢性社交挫敗應(yīng)激（CSDS）
模型的建立CSDS模型的構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)：Golden SA，Covington HE 3rd，Berton O，et al. A standardizedprotocol for repeated social defeat stress in mice［J］. Nat Protoc，2011，6（8）：1183-1191.
將CD-1小鼠單籠飼養(yǎng) 7 d 產(chǎn)生領(lǐng)地意識(shí)，C57BL/6 小鼠 4~5只飼養(yǎng) 7 d 適應(yīng)環(huán)境。首先篩選 CD-1 小鼠的攻擊性，將C57BL/6小鼠置CD-1小鼠籠中3 min，若CD-1小鼠發(fā)起攻擊多于 5 次且攻擊潛伏期< 1 min，認(rèn)為有攻擊性，在 3 d 中至少 2 次有攻擊性，可作為模型中的攻擊鼠。實(shí)驗(yàn)組（Sus）小鼠進(jìn)行 10 d 的 CSDS，即將實(shí)驗(yàn)組 C57BL/6 小鼠連續(xù) 10 d 放入 CD-1 小鼠籠中，被攻擊 5~10 min后用一帶孔透明亞克力板隔離24 h，每tian更換新的CD-1小鼠避免適應(yīng)。10 d后將實(shí)驗(yàn)組C57BL/6小鼠取出并單籠飼養(yǎng)。而非應(yīng)激對(duì)照組（Con）為同周齡C57BL/6小鼠，每tian與無(wú)攻擊性 C57BL/6 小鼠接觸 5~10 min 后用相同的板隔離24 h，每tian更換新的C57BL/6小鼠。10 d結(jié)束后將非應(yīng)激對(duì)照組C57BL/6小鼠取出并單籠飼養(yǎng)。
四、CSDS模型的檢測(cè)方法
10天連續(xù)應(yīng)激結(jié)束后即開(kāi)始行為學(xué)測(cè)試。根據(jù)糖水消耗，社會(huì)接觸的行為學(xué)和懸尾測(cè)試的結(jié)果將C57小鼠分為正常組，抑郁敏感組，抑郁非敏感組。
（1）糖水偏好實(shí)驗(yàn)
糖水偏好測(cè)試是檢測(cè)抑郁癥快感缺失的經(jīng)典方法。根據(jù)文獻(xiàn)稍做修改。首先給予小鼠兩瓶清水，24 h后將其中一瓶換成1%蔗糖溶液，稱重并記錄兩瓶質(zhì)量，12 h后交換瓶的位置避免方向偏好，經(jīng)過(guò) 24 h 測(cè)試后再次稱重，糖水偏好系數(shù)為：糖水消耗質(zhì)量/總消耗質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)：Liu MY，Yin CY，Zhu LJ，et al. Sucrose preference test for measurement of stress -induced anhedonia in mice［J］. Nat Protoc，2018，13（7）：1686-1698.
測(cè)試前用自來(lái)水配制好1%蔗糖水，與不含蔗糖的正常自來(lái)水同時(shí)放在C57模型鼠的鼠籠處，保證其自由飲用，同時(shí)提供充足的鼠食，每12h將糖水和白水互換位置，以防止C57模型鼠產(chǎn)生位置偏好。到第三天將所有的水和食物同時(shí)撤走，將C57模型鼠禁食24 h。禁食結(jié)束后分別稱量糖水和白水的重量并記錄，然后將兩瓶水隨機(jī)放在飼養(yǎng)籠上供模型鼠自由飲用，1h后取下兩瓶水分別測(cè)量?jī)善克Ｏ碌闹亓浚?jì)算出糖水消耗重量A和白水消耗重量B，利用公式A/（A+B）X 100%即得到CSDS模型鼠的糖水偏好率。糖水偏好率的值與動(dòng)物的快感程度呈正相關(guān)，其值越小則表明動(dòng)物快感缺失越嚴(yán)重。
（2）社會(huì)互動(dòng)實(shí)驗(yàn)/社會(huì)接觸實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)方法主要用于檢測(cè)小鼠對(duì)陌生目標(biāo)的靠近，探索和躲避行為。正常的嚙齒類動(dòng)物是社會(huì)性動(dòng)物，當(dāng)正常鼠與陌生鼠相遇后會(huì)與陌生鼠頻繁接觸;而遭受過(guò)社會(huì)挫敗應(yīng)激的小鼠則會(huì)產(chǎn)生孤立和逃避接觸的行為，該行為一般判定為抑郁樣行為;而相比之下，在一定的時(shí)間內(nèi)，正常鼠在單位時(shí)間內(nèi)與正常鼠接觸的時(shí)間明顯長(zhǎng)于模型鼠在單位時(shí)間內(nèi)與正常鼠接觸的時(shí)間，因此，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)計(jì)算出模型鼠與攻擊鼠接觸的時(shí)間能反應(yīng)出模型鼠的抑郁程度。其具體操作方法是:在敞箱(45X45 X 45cm)一側(cè)的中央放入隔板(10 x 6cm，底部有密集小孔，用來(lái)放置陌生CD1小鼠)，以中央放置CD1小鼠的區(qū)域?yàn)橹行模瑒澇鲆痪匦螀^(qū)域作為接觸區(qū)域(14x26 cm ) }46}。結(jié)果通過(guò)由上海欣軟信息科技有限公司公司提供的VisuTrack軟件進(jìn)行接觸時(shí)間的統(tǒng)計(jì)。使用VisuTrack 軟件記錄小鼠在社交互動(dòng)區(qū)以及角落區(qū)的時(shí)間，社交互動(dòng)比率（social interaction，SI）為：第2階段在互動(dòng)區(qū)的時(shí)間/第1階段在互動(dòng)區(qū)的時(shí)間。認(rèn)為 SI<1 的小鼠表現(xiàn)出社交回避為敏感型，SI>1的小鼠表現(xiàn)出社交偏好為抵抗型。整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟如下:
（1）打開(kāi)軟件和攝像頭后將實(shí)驗(yàn)籠放置到合適的位置，然后進(jìn)行軟件的設(shè)置;
（2）不放入陌生的CD1小鼠，然后放入C57小鼠，然后開(kāi)始計(jì)時(shí)，時(shí)間設(shè)定為2.5 min，zui后得到接觸區(qū)和非接觸區(qū)的累積時(shí)間，此階段為Target absent;
（3）放入陌生的CD1小鼠，然后放入C57小鼠，然后開(kāi)始計(jì)時(shí)，時(shí)間設(shè)定為2.5 min，zui后得到接觸區(qū)和非接觸區(qū)的累積時(shí)間，此階段為Target present;
（4）分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和模型組的Target absent和Target present的累積時(shí)間，在Target absent階段，對(duì)照組和模型鼠無(wú)明顯差異，但是在Target present階段，模型鼠的接觸時(shí)間明顯降低。
（3）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)
強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) ：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁樣行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)［12］。實(shí)驗(yàn)裝置為3 L燒 杯，在其中加2 L清水，水溫在（22±1）℃，2只動(dòng)物之間應(yīng)更換清水。實(shí)驗(yàn)第 1 天將小鼠置燒杯中，游泳15 min 后取出擦干。第 2 天將小鼠置燒杯中，計(jì)時(shí)6 min，記錄后4 min的不動(dòng)時(shí)間。
懸尾實(shí)驗(yàn)：將高60cm的架子放置于安靜的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，用夾子夾住小鼠尾巴末端1cm處，然后將夾子固定在架子上，使其倒吊于架子上，小鼠為克服不正常體位而掙扎活動(dòng)，在此期間記錄小鼠的不動(dòng)時(shí)間。總共時(shí)間為6min，開(kāi)始1min為適應(yīng)時(shí)間，隨后5min為記錄時(shí)間，記錄分析軟件同樣為VisuTrack軟件。
（4）高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)
高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是對(duì)焦慮樣行為進(jìn)行分析的經(jīng)典測(cè)試。迷宮由2條垂直的跑道（寬 5 cm×長(zhǎng) 35 cm）組成，一條跑道由15 cm高墻包裹（閉合臂），另一條跑道無(wú)包裹（開(kāi)放臂）。2 個(gè)臂通過(guò)中心區(qū)域（5 cm×5 cm）連接，距地面 40 cm。在測(cè)試開(kāi)始時(shí)，將小鼠置中央?yún)^(qū)域面對(duì)開(kāi)放臂，記錄在開(kāi)放臂和閉合臂上的時(shí)間，整個(gè)實(shí)驗(yàn)共記錄5 min。
（5）Y 迷宮實(shí)驗(yàn)
Y 迷宮實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)小鼠的空間記憶能力。迷宮由 3 個(gè)臂組成（8 cm×30cm×15 cm），兩臂間夾角為 120°。在第1階段將其中一個(gè)臂關(guān)閉，放入小鼠任其自由探索15 min。1 h后開(kāi)始第2階段，打開(kāi)先前關(guān)閉的臂，計(jì)時(shí)5 min，記錄小鼠在新臂中的探索時(shí)間。
五、探討
（1）CSDS引起小鼠生理指標(biāo)改變
我們發(fā)現(xiàn)，在CSDS模型中經(jīng)過(guò)10 d的社交挫敗應(yīng)激之后，應(yīng)激敏感組小鼠（n=23）的體質(zhì)量與非應(yīng)激對(duì)照組小鼠（n=20）相比顯著減輕（P=0.002）。與此同時(shí)，對(duì)兩組小鼠進(jìn)行血糖監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著社交挫敗應(yīng)激的進(jìn)行，敏感組小鼠的血糖逐漸增加。
（2）CSDS引起小鼠焦慮樣行為
我們通過(guò)曠場(chǎng)和高架十字等行為學(xué)方法對(duì)CSDS模型小鼠的焦慮樣負(fù)性情緒進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，與非應(yīng)激對(duì)照組小鼠（n=18）相比，應(yīng)激敏感型小鼠（n=21）在曠場(chǎng)中活動(dòng)的距離顯著降低（P=0.0008），表現(xiàn)出探索減少的行為。同時(shí)，小鼠在曠場(chǎng)中心位置活動(dòng)的時(shí)間也顯著減少（P=0.0002），更喜歡貼壁行走或躲在角落中。可見(jiàn)，應(yīng)激敏感組小鼠表現(xiàn)出更高的焦慮樣行為。但在采用高架十字迷宮進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激敏感組小鼠（n=21）較非應(yīng)激對(duì)照組小鼠（n=18）在開(kāi)放臂的活動(dòng)時(shí)間也稍有減少，但未見(jiàn)顯著差異（P=0.3）。
（3）CSDS導(dǎo)致小鼠抑郁樣行為
我們借助糖水偏好實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以及懸尾實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁樣行為的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)， 對(duì) CSDS 模型小鼠進(jìn)行了系統(tǒng)研究。其中，糖水偏好實(shí)驗(yàn)反映小鼠是否出現(xiàn)快感缺失；強(qiáng)迫游泳以及懸尾實(shí)驗(yàn)反映小鼠是否存在絕望行為，這兩點(diǎn)是抑郁癥患者的經(jīng)典行為改變。
（4）CSDS引起小鼠空間記憶受損
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