原始文獻：

Zhang, X., Kim, J., & Tonegawa, S. (2020). Amygdala Reward Neurons Form and Store Fear Extinction Memory.Neuron, 105(6).

原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627319310918www.sciencedirect.com

恐懼消退需要形成新的印跡（engram）細胞。
恐懼消退印跡細胞存在于基底外側杏仁核的Ppp1r1b+神經元中。
恐懼消退印跡細胞和獎賞相關神經元是高度重疊的，功能上相互轉換。
恐懼消退記憶是一種獎賞記憶——期望中有害刺激的缺失是一種獎賞。

恐懼行為是神經科學研究中的一個重要課題。在模式動物上研究恐懼行為的一個常見方法就是利用恐懼條件反射，即同時給予動物無害刺激（條件刺激，CS）和有害刺激（非條件刺激，US），使動物對無害刺激形成條件反射。恐懼記憶形成后，長時間給予動物單純的條件刺激能夠使動物的恐懼條件反射減弱，這被稱作恐懼消退（fear extinction）。杏仁核（amygdala）被認為是一個與恐懼密切相關的腦區。之前的研究已經發現，基底外側杏仁核（basolateral amygdala，BLA）中存在兩類神經元，Ppp1r1b+神經元和Rspo2+神經元（根據特定的基因表達區分），它們分別對正價刺激和負價刺激起反應，并且相互間存在拮抗作用。本文的作者就試圖研究Ppp1r1b+神經元在恐懼消退中的作用。

研究人員以小鼠為實驗對象采用了一個環境依賴的恐懼消退范式。實驗組小鼠在第Yi天在實驗籠中接受三個周期的電刺激，對環境產生恐懼記憶。第er天小鼠仍被放入實驗籠中，但不再有電刺激，以此進行恐懼消退的訓練。第三天小鼠再一次被放入無電刺激的實驗籠中進行測試。另外有兩個對照組實驗：無恐懼消退訓練的NonExt組和始終無電刺激的NonShock組。實驗組和NonExt組在第Yi天實驗中，恐懼表現（freezing）逐漸明顯；經過第er天的消退訓練后，實驗組的恐懼程度顯著低于NonExt組，而NonShock組的恐懼表現始終處于極低的水平。

研究人員隨即對實驗組和對照組的小鼠腦組織進行了單分子熒光原位雜交（smFISH）來檢測Fos、Rspo2、Ppp1r1b的表達情況。熒光結果顯示，Rspo2+神經元的活性在仍具有恐懼記憶的NonExt組小鼠中顯著，而在實驗組和NonShock組小鼠中沒有顯著區別；Ppp1r1b+神經元僅在發生了恐懼消退的實驗組小鼠中被激活。

接下來研究人員又利用顯微內窺鏡進行在體鈣成像追蹤Rspo2+神經元和Ppp1r1b+神經元在恐懼消退實驗期間的激活動態。Rspo2+神經元在第Yi天受到電刺激時（恐懼習得）以及第er天剛進入實驗籠時（恐懼取回）活性上升，在恐懼消退過程中及第三天的測試中活性降低。Ppp1r1b+神經元則剛好相反，在恐懼消退過程中及恐懼消退后具有高活性。研究者也發現，在恐懼習得中被激活的Rspo2+神經元，大多會在恐懼取回時被再度激活；而在恐懼消退過程中被激活的Ppp1r1b+神經元，也大多會在第三天的恐懼消退測試中被再度激活。鈣成像的結果與c-Fos一致，反映了Ppp1r1b+神經元在恐懼消退中被激活，而恐懼激活的Rspo2+神經元在恐懼消退中活性受抑制。

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研究人員分別向Rspo2-Cre小鼠和Ppp1r1b-Cre小鼠中注射攜帶有ChR2或eArchT的Cre依賴AAV病毒，特異性標記并操縱Rspo2+神經元和Ppp1r1b+神經元。光遺傳實驗顯示，在恐懼消退期間激活Rspo2+神經元或抑制Ppp1r1b+神經元能夠顯著降低恐懼消退的程度，而激活Ppp1r1b+神經元或抑制Rspo2+神經元可以促進恐懼消退（加速習得過程），但對恐懼消退的Z終結果沒有影響。在恐懼消退習得完成后（第三天測試時）抑制Ppp1r1b+神經元可以逆轉消退學習的結果，但激活該神經元則無顯著影響。光遺傳實驗的結果進一步表明了這兩類神經元在恐懼消退中的拮抗作用，以及Ppp1r1b+神經元在恐懼消退的記憶中的重要作用。

研究人員接下來開始探究能否在pBLA的Ppp1r1b+神經元中找到恐懼消退的印跡（engram）細胞。研究人員向Ppp1r1b-Cre小鼠的pBLA中注射了下圖所示的AAV病毒，使他們能夠在特定時間標記上激活了的Ppp1r1b+神經元并對其進行遺傳操作。已經恐懼消退完成的小鼠在第三天的測試時激活的Ppp1r1b+神經元被標記并轉入ChR2。這些小鼠再一次經歷了三天的恐懼消退實驗，而光激活上述被標記的Ppp1r1b+神經元能夠顯著提升恐懼消退的速度。對Rspo2+神經元進行同樣的實驗則沒有任何顯著結果。利用同樣的方法，向被標記的Ppp1r1b+神經元中轉入ArchT，光抑制這些Ppp1r1b+神經元可以顯著逆轉恐懼消退的結果，并且Rspo2+神經元的活性顯著提高。這些結果表明，恐懼消退記憶的印跡細胞確實存在于Rspo2+神經元中，這些印跡細胞對恐懼消退記憶的維持其中重要的作用，并且能夠抑制與恐懼有關的Rspo2+神經元的活動。

摘自原文Fig4，只有被激活并且表達Ppp1r1b的神經元會被轉入ChR2-EYFP／EYFP，并且該序列的表達可以通過給小鼠喂食doxycycline (Dox)進行抑制，因此研究人員可以標記上特定時間的目標神經元。

之前的研究表明，pBLA中的Ppp1r1b+神經元有一部分對飲食獎賞有反應，研究人員接下來研究了這兩種Ppp1r1b+神經元間的關系。小鼠被禁水Yi天后再給予飲水獎賞，研究人員用病毒注射標記上了對獎賞起反應的Ppp1r1b+神經元。小鼠接下來被分為四組，分別進行禁水+給水，禁食+給食，恐懼消退，恐懼（無消退，即NonExt組）的實驗。研究人員隨即檢測了c-Fos表達情況，結果顯示，飲水獎勵、進食獎勵和恐懼消退的三組小鼠之間，被標記的Ppp1r1b+神經元中表達c-Fos的比例和表達c-Fos的神經元中被標記的比例都沒有顯著差異，但都顯著高于NonExt組。這一結果顯示對獎賞起反應的Ppp1r1b+神經元與恐懼消退相關的Ppp1r1b+神經元有著很高的重疊度。動態的鈣成像實驗也進一步證明了這一結果。

研究人員還用神經元被標記/遺傳操作的小鼠進行了光遺傳自我刺激行為測試（optogenetic self-stimulation behavior test）和光遺傳實時空間偏好測試（optogenetic real-time place preference test）。無論是通過飲水獎勵還是恐懼消退標記上Ppp1r1b+神經元的小鼠，都有相當一部分表現出了自我刺激行為或空間偏好（即有主動激活Ppp1r1b+神經元的偏好）。而光激活通過飲水獎勵標記/遺傳操作的Ppp1r1b+神經元也能夠提高恐懼消退的速度。這些結果進一步表明了與恐懼消退相關的和與飲食獎賞相關的Ppp1r1b+神經元是高度相關的，恐懼消退在神經元水平上可以被認為是一種獎賞。

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